本文標(biāo)題："熒光顯微鏡技術(shù)定位熒光動物細(xì)胞-圖像顯微鏡"
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熒光顯微鏡技術(shù)定位熒光動物細(xì)胞-圖像顯微鏡
為很多哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒中所用的強(qiáng)啟動子能引起熒光蛋白過表達(dá)
的級聯(lián)放大效應(yīng)，并且熒光蛋白的桶狀結(jié)構(gòu)可以使其較弱[如水母(
Aequorea victoria)突變體]或者較強(qiáng)[如某些珊瑚和異輻?？?Dis
co一50ma and Heteractis crispa)突變體]地自我交聯(lián)。6．開始
實驗時，應(yīng)考慮到整個研究的時間進(jìn)程。如果實驗進(jìn)程很快，成像
的間隔時間應(yīng)該很小或為零。在這種情況下，影像掃描和影像收集
也要迅速。由于信噪比會隨所收集的光子數(shù)目的平方根增加(即掃
描時間越長，信噪比越好)，增加幀頻通?？山档托旁氡取Ｓ捎谶M(jìn)
程較慢的研究掃描時間更長，并且有更長的時間間隔，因此可以減
少這些限制。兩種情況均應(yīng)考慮整個激發(fā)時間以減少光漂白效應(yīng)。
7．使用傳統(tǒng)的熒光顯微鏡技術(shù)定位目的熒光細(xì)胞后，首先調(diào)節(jié)焦
距、激發(fā)水平和探測器的捕獲能力，在較短的時間內(nèi)掃描細(xì)胞，探
測器可以從感興趣的焦平面獲取足夠的信號。要盡可能快地完成這
些步驟，以減輕甚至在實驗開始前就開始的光漂白效應(yīng)。如果最早
一次的成像可行，那么在以后所有的GFP時延性實驗中，采用已經(jīng)
摸索出的設(shè)備參數(shù)，如掃描時間，激發(fā)水平和檢波器的捕獲和篩檢
，保持成像的一致性，或至少可以作為一個良好的起點(diǎn)。8．設(shè)置
圖像理想的像素大小。許多設(shè)備有可選擇的范圍(64像素×64像素
～2048像素×2048像素)。通常，每平方微米的像素越多，影像就
越清晰；然而，這些高像素的影像在同樣的像素設(shè)置時間中需要更
長時問的掃描，并且需要更多的儲存空間。記住為了使數(shù)碼影像保
持空問分辨率，應(yīng)該調(diào)整像素的大小到每個可分解單元≥2個像素
?？煞纸鈫卧?r)取決于物鏡的光圈(NA)和激發(fā)光的波長Q)(r—o．
61 xz／NA)。9．為每個影像設(shè)置理想的掃描時間。像前面提到的
，研究進(jìn)程的相對速度在一定程度上決定掃描時間。通過改變像素
設(shè)置時間(每個像素收集熒光的時間)改變總的掃描時間或者平均一
個像素所需要的時間(多次影像掃描后，單個像素收集的總熒光除
以掃描次數(shù))。簡單地說，改變掃描時間在本例中不會引起差別。
然而，如果使用平均像素，則應(yīng)考慮到與畫面平均(重復(fù)掃描整張
影像)相對的線平均(用平均的像素重復(fù)掃描單一的像素線，進(jìn)行平
均)與平均畫面。在活細(xì)胞中，熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)可能正在細(xì)胞中
運(yùn)動，而且平均畫面像素經(jīng)過掃描一整張影像所需要的時間在不同
的時間點(diǎn)被收集。這樣將會使熒光信號在比平常更大的范圍內(nèi)丟失
。然而，線平均或者改變像素設(shè)置時間，以及考慮改變掃描時間和
進(jìn)展速度可以降低或者消除
這種丟失效應(yīng)。
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